本研究以乙酰檸檬酸三丁酯（ATBC） 為研究對象，通過網(wǎng)絡(luò)毒理學(xué)與分子對接策略探究其誘導(dǎo)腦 毒性的機制。利用 ChEMBL 、STITCH 、GeneCards 等數(shù)據(jù)庫篩選出與ATBC 暴露和腦損傷相關(guān)  的213 個潛在靶點，經(jīng) STRING 和 Cytoscape 分析得到23 個核心靶點（包括 AKT1 、CASP3、HSP90AA1 等）；GO 和 KEGG 分析顯示核心靶點主要富集于癌癥相關(guān)通路、神經(jīng)活性配體 - 受  體相互作用通路等；分子對接（Autodock）證實 ATBC 與核心靶點結(jié)合能 < 0 ，結(jié)合穩(wěn)定。研究表 明，ATBC 可能通過調(diào)控腦細(xì)胞凋亡增殖、激活炎癥通路、影響神經(jīng)可塑性，增加腦癌風(fēng)險、引發(fā) 神經(jīng)炎癥，并可能導(dǎo)致認(rèn)知障礙和神經(jīng)退行性疾病，為 ATBC 腦毒性機制及環(huán)境污染物毒性評估提 供理論基礎(chǔ)。

研究背景

乙酰檸檬酸三丁酯（ATBC）是一種由檸檬酸酯化形成的有機化合物，它是聚氯乙烯（PVC）和其他聚合物材料常用的shou選增塑劑。目前，ATBC通常被認(rèn)為是一種安全的增塑劑，只有在 非常高的濃度下才被認(rèn)為有毒。然而，ATBC的遷移率高達(dá)79.8 mg/kg ，約為鄰苯二甲酸酯（PAEs）的10倍，引發(fā)了人們對其潛在暴露風(fēng)險的擔(dān)憂。并且ATBC缺乏與塑料中聚合物的化  學(xué)結(jié)合，很容易塑料制品中浸出，然后擴(kuò)散到血液、體液、室內(nèi)空氣、灰塵、環(huán)境土壤和水中。

由于ATBC的消耗量不斷增加，其遷移率和可浸出性也很高，因此需要制定一種新的策略來全 面評估ATBC的健康安全性和風(fēng)險，并深入研究其潛在毒理學(xué)機制。考慮到暴露于PAEs所產(chǎn)生 的神經(jīng)毒性作用和潛在的病理性腦損傷，可以合理地假設(shè)具有類似化學(xué)結(jié)構(gòu)的ATBC也可能對 大腦產(chǎn)生不良毒性影響。并且ATBC暴露時間延長，腦損傷的可能性增加。

研究方法和內(nèi)容

•數(shù)據(jù)來源與工具：

•數(shù)據(jù)庫：ChEMBL、STITCH（獲取 ATBC 靶點）；GeneCards、OMIM（獲取腦損傷靶點）；DAVID、FUMA（GO/KEGG 分析）。

•分析工具：STRING（構(gòu)建蛋白 - 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，PPI）；Cytoscape 3.8.2（篩選核心靶點）；Autodock（分子對接）。

•核心靶點篩選標(biāo)準(zhǔn)：需同時滿足：①介數(shù)中心性 > 中位數(shù)；②緊密性中心性 > 中位數(shù)；③平均最短路徑長度 > 中位數(shù)；④度值 > 2 倍中 位數(shù)。

應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)毒理學(xué)和分子對接分析ATBC對腦損傷的假定毒性。

揭示ATBC介導(dǎo)的腦損傷的核心靶點和關(guān)鍵通路。

促進(jìn)網(wǎng)絡(luò)毒理學(xué)和分子對接技術(shù)對緊急環(huán)境化學(xué)品的毒性和潛在分子機制進(jìn) 行有效評估。

研究結(jié)果

 01   靶點篩選結(jié)果

從 ChEMBL 和 STITCH 篩選出256 個 ATBC 靶點，從 GeneCards 和 OMIM 篩選出8841個腦損傷高相關(guān)靶點，經(jīng)整合去重得到213 個潛在靶點（ATBC 誘導(dǎo)腦毒性的交集靶點）。

圖 1  乙酰檸檬酸三丁酯（ATBC）與腦 損傷相關(guān)靶點的維恩圖

02   潛在靶點的互作網(wǎng)絡(luò)及核心靶點的獲取

利用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建了潛在靶點的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI），共得到212個 節(jié)點和569條邊。

通過對互作網(wǎng)絡(luò)的分析，作者識別了23個與ATBC引起腦毒性相關(guān)的核心靶點，并對這些核 心靶點重新構(gòu)建了互作網(wǎng)絡(luò)。其中AKT1 、CASP3和HSP90AA1是top3的靶點

圖 2  潛在靶點的蛋白質(zhì) - 蛋白質(zhì)相互作 用（PPI）網(wǎng)絡(luò)

 圖 3  核心靶點的蛋白質(zhì) - 蛋白質(zhì)相互作 用（PPI）網(wǎng)絡(luò)

03   潛在靶點功能分析和通路富集分析

 潛在靶點與核心靶點主要富集于癌癥相關(guān)通路、神經(jīng)活性配體 - 受體相互作用通路、鈣信號 通路、cAMP 信號通路等，與腦損傷類型一致。

圖 4. 潛在靶點的 GO 富集分析（qian10 位）

(A) 該柱狀圖展示了 213 個潛在靶點在基因本體論（GO）的三個類別（生物過程 BP 、細(xì)胞組分 CC 、分子功能 MF）中，經(jīng)錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR） 排序后qian10 位的顯著富集條目。FDR 值反映富集的統(tǒng)計學(xué)顯著性，數(shù)值越小表明顯著性越高；柱形高度對應(yīng)基因計數(shù)，體現(xiàn)該類別內(nèi)的富集   程度。這些富集條目凸顯了可能受 ATBC 暴露影響的關(guān)鍵生物過程、細(xì)胞組分和分子功能。

(B) 氣泡大小對應(yīng)特定通路中的基因表達(dá)量，氣泡的顏色飽和度表示富集顯著性。

   5. 潛在靶點的 KEGG 富集分析（前 20 位）

(A) 該氣泡圖以 FDR 值倒序展示了前 20 位顯著富集的 KEGG 信號通路。每個氣泡代表一個特定通路，氣泡面積表示該通路中富集的基因數(shù)量，顏色 深度（紅色越深）表示富集顯著性越高。213 個交集基因主要參與多種 KEGG 通路，其中神經(jīng)活性配體 - 受體相互作用及相關(guān)信號通路尤為突出。

(B) 該柱狀圖展示了各通路的富集頻率與顯著性，柱形長度對應(yīng)基因計數(shù)（反映富集分?jǐn)?shù)和顯著性水平），柱形越高表示基因計數(shù)越多、富集程度越高。 圖中簡明直觀地呈現(xiàn)了與 ATBC 誘導(dǎo)腦毒性密切相關(guān)的前 20 位富集 KEGG 信號通路。

04   核心靶點的通路富集分析

 利用DAVID和FUMA數(shù)據(jù)庫對23個核心靶點進(jìn)行經(jīng)典通路分析，包括KEGG富集分析和Reactome富集分析。

  6 . 核心靶點 KEGG 富集分析的重疊基因水平梯度柱狀圖（前 20 位）

05   ATBC和腦損傷核心靶蛋白的分子對接

利用AutoDock軟件對ATBC和五個核心靶點（AKT1 ，CASP3 ，HSP90AA1 ，ESR1和MMP9） 的相互作用進(jìn)行了分子對接分析。5個對接結(jié)果均顯示出較低的結(jié)合能，都可以自發(fā)結(jié)合，表  明ATBC與靶點之間具有較強的親和力。

圖 7. 各靶蛋白與 ATBC 的最di結(jié)合能分子對接結(jié)果

(A) ATBC 與絲氨酸 / 蘇氨酸激酶 1（AKT1）的對接結(jié)果；

(B) ATBC 與半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 3（CASP3）的對接結(jié)果；

(C) ATBC 與熱休克蛋白 90α 家族 A 成員 1（HSP90AA1）的對接結(jié)果；

(D) ATBC 與雌激素受體 1（ESR1）的對接結(jié)果；

(E) ATBC 與基質(zhì)金屬蛋白酶 9（MMP9）的對接結(jié)果。

討論與結(jié)論 

1. 毒性機制推測：ATBC 可能通過調(diào)控腦癌細(xì)胞凋亡與增殖、激活炎癥信號通路、調(diào)節(jié)神經(jīng)可塑性，影響腦癌發(fā)生發(fā)展、引發(fā)神經(jīng)炎癥，并 增加認(rèn)知障礙和神經(jīng)退行性疾病風(fēng)險。

 2. 研究意義：為理解 ATBC 腦毒性分子機制提供理論基礎(chǔ)，建立環(huán)境污染物毒性高效評估策略，為相關(guān)疾病預(yù)防治療提供依據(jù)。

 3. 局限性：現(xiàn)有動物研究多為高劑量短期暴露，與人類低劑量長期暴露場景差異大，需進(jìn)一步長期流行病學(xué)和動物實驗驗證。

研究意義及創(chuàng)新點

  1 ：本研究如何篩選出ATBC 誘導(dǎo)腦毒性的核心靶點？涉及哪些數(shù)據(jù)庫和工具？

研究首先通過 ChEMBL 和 STITCH 數(shù)據(jù)庫篩選出 256 個 ATBC 相關(guān)靶點，通過 GeneCards 和 OMIM 數(shù)據(jù)庫篩選出 8841 個腦損傷高相關(guān)靶點，經(jīng)整合去重得到 213 個潛在交集靶點；隨后利用 STRING 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白 - 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)（212 個節(jié)點，569 條邊），并通過 Cytoscape 軟件分析節(jié)點拓?fù)鋵傩裕罱K篩選出 23 個核心靶點，篩選標(biāo)準(zhǔn)為介數(shù)中心性、緊密性中心性、平均最短路徑長度均 > 中位數(shù)，且度值 > 2 倍中位數(shù)。

2：ATBC 誘導(dǎo)腦毒性的核心靶點和關(guān)鍵通路有哪些？它們?nèi)绾螀⑴c腦損傷過程？

核心靶點包括 AKT1 、CASP3 、HSP90AA1 、ESR1 、MMP9 等（其中 AKT1 度值最高，為 101）；關(guān)鍵通路主要為癌癥相關(guān)通路、神經(jīng)活性配體 - 受體相互作用通路、 鈣信號通路。這些核心靶點通過調(diào)控腦癌細(xì)胞凋亡與增殖（如 AKT1 調(diào)控細(xì)胞存活，CASP3 介導(dǎo)凋亡）、激活炎癥信號（如 HSP90AA1 促進(jìn)慢性炎癥）、破壞血腦屏  障與調(diào)節(jié)神經(jīng)可塑性（如 MMP9 參與免疫炎癥與血腦屏障破壞），最終導(dǎo)致腦癌風(fēng)險增加、神經(jīng)炎癥及認(rèn)知功能下降。

3 ：本研究采用的網(wǎng)絡(luò)毒理學(xué)與傳統(tǒng)毒理學(xué)方法相比，有何優(yōu)勢？

相比傳統(tǒng)毒理學(xué)方法，網(wǎng)絡(luò)毒理學(xué)優(yōu)勢在于：①系統(tǒng)性：整合多數(shù)據(jù)庫和組學(xué)數(shù)據(jù)，從整體網(wǎng)絡(luò)層面分析污染物與靶點、通路的相互作用，避免傳統(tǒng)方法僅關(guān)注孤立靶 點的局限性；②高效性：通過生物信息學(xué)工具快速篩選靶點和通路，縮短對新興環(huán)境污染物毒性評估的周期，適應(yīng)大量未表征化學(xué)品的評估需求；③預(yù)測性：結(jié)合分子 對接等技術(shù)預(yù)測潛在相互作用，可針對低劑量長期暴露場景（更貼近人類實際暴露）提供機制推測，彌補動物高劑量短期實驗的不足。