核蛋白WB實驗

蛋白樣品制備的注意事項：

1、細胞數(shù)量達5×106

2、將細胞裂解液再離心，收集上清液，加loading煮樣5min。

SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳注意事項：

1、做膠：防止漏膠、進氣泡以及花膠（水封、插梳子和拔梳子）

2、加樣：兩邊加loading，加樣量一樣，加樣時間要盡量短，以免樣品擴散。

3、電泳：將膠夾好放于電泳槽中，加電泳buffer（內(nèi)外面不能聯(lián)通），將電壓調(diào)到90V開始電泳。

轉(zhuǎn)膜注意事項：

1、泡膜：轉(zhuǎn)膜之前將海綿、膠、膜都用預冷的轉(zhuǎn)移buffer浸泡20min。（1.凝膠若是沒在預冷的轉(zhuǎn)膜buffer中浸泡，就會在轉(zhuǎn)膜過程中出現(xiàn)凝膠皺縮，導致出現(xiàn)轉(zhuǎn)移條帶變形。2.PVDF膜具有疏水性，需用甲醇浸泡）

2、轉(zhuǎn)膜順序：陰極碳板+海綿+三濾+膠+膜+三濾+海綿+陽極碳板

3、轉(zhuǎn)膜條件：0.35A 250V 1h40min 冰浴中進行轉(zhuǎn)膜（具體轉(zhuǎn)膜時間要根據(jù)目的蛋白的大小而定；目的蛋白的分子量越大，需要的轉(zhuǎn)膜時間越長，反之則短）

4、避免直接用手碰雜交膜，使用鑷子。因為手上的蛋白和油脂會影響轉(zhuǎn)膜效率并會使膜臟掉。

5、夾好膜和凝膠后，確定在凝膠/膜和濾紙之間沒有氣泡存在，否則會導致轉(zhuǎn)膜不*。

6、保證膜和濾紙的大小和凝膠*一樣，過大和過小都會影響轉(zhuǎn)膜效率。

7、雞來源的抗體與PVDF和尼龍膜有較強的結合能力，從而產(chǎn)生較高的背景，故如果選擇雞來源的抗體使用硝酸纖維素膜（NC膜）

關于磷酸化蛋白檢測的注意事項：

1、保持待測蛋白處于磷酸化狀態(tài)！在標本提取液中加入足夠的磷酸酶抑制劑（NaF，可以防止去磷酸化），并將標本時刻保持在冰浴中！

2、使用5%的BSA作為封閉試劑！不能使用脫脂奶粉！（因為脫脂奶粉中含有酪蛋白，會出現(xiàn)很高的背景）。

抗體保存注意事項：

1、收到抗體后按要求離心后再打開管蓋進行分裝盒保存！

2、對于大部分抗體，比較合適的保存方式是分裝后保存在-20℃

  2.1 分裝的量以一次實驗用完為好，少不能少于10μl每份。因為分裝體積越小，抗體的濃度越可能會受到蒸發(fā)以及管壁吸附的影響。

  2.2 復融后的分裝抗體如果一次用不完，將剩余母液保存在4℃，避免再凍起來！

  2.3 避免將抗體保存在自動除霜冰箱中。

3、大部分抗體收到后4℃短暫保存1-2周對抗體活性是沒有影響的。

4、長期保存，加入疊氮鈉，防止細菌污染。