微生物基因編輯實驗

一、微生物基因編輯的定義與基本原理

微生物基因編輯指通過人工手段對細菌、酵母等微生物的基因組進行精確修改的技術，其核心原理是利用分子工具靶向定位目標DNA位點，誘導DNA雙鏈斷裂（DSB），并利用細胞自身的修復機制實現基因插入、刪除或替換。該過程分為三個關鍵步驟：

1. 靶向定位：使用向導RNA（sgRNA）或特定蛋白（如鋅指蛋白）識別目標DNA序列。CRISPR-Cas9系統通過sgRNA與目標DNA的互補配對實現精準定位，且需鄰近PAM序列（如Cas9依賴5'-NGG-3'）。

2. DNA切割：核酸酶（如Cas9）在靶點切割DNA形成雙鏈斷裂。CRISPR-Cas9系統中，Cas9的HNH和RuvC結構域分別切割互補鏈與非互補鏈。

3. 細胞修復：

• 非同源末端連接（NHEJ） ：易出錯，導致隨機插入/缺失，適用于基因敲除。

• 同源定向修復（HDR） ：需供體DNA模板，實現精確插入或替換。
  

   

二、常用技術方法及迭代演進

1. CRISPR-Cas9系統（主流工具）：

• 優勢：操作簡便、成本低、效率高，可多重編輯。

• 流程：設計sgRNA→與Cas9蛋白組裝→導入微生物細胞→切割靶DNA→修復機制啟動。

• 變體改進：

• 高保真Cas9：減少脫靶效應（如SaCas9識別罕見PAM序列NNGRRT）。

• 堿基編輯器（BE） ：融合脫氨酶與nCas9，實現C→T或A→G單堿基替換，無需DSB。

• 先導編輯（Prime Editing） ：nCas9-逆轉錄酶融合體，通過pegRNA模板直接寫入新序列，精度更高。

2. 早期編輯工具：

• 鋅指核酸酶（ZFNs） ：鋅指蛋白識別DNA，FokI核酸酶切割。設計復雜且成本高。

• TALENs：轉錄激活因子識別DNA，FokI切割。靈活性優于ZFNs，但仍需蛋白工程。

3. 新興技術：

• Retron與CRISPR聯用：利用逆轉錄子產生ssDNA模板，結合CRISPR實現多位點同步編輯。

• CRISPR-FrCas9堿基編輯器：寬PAM兼容性（如5'-NRN-3'）、無堿基偏好性，適用于非模式微生物。

三、應用場景與典型案例

1. 工業生物技術

• 生物制造：

• 大腸桿菌敲除競爭途徑基因，提高生物燃料產量。

• hei曲霉（Aspergillus niger）刪除pyrG、gluF等基因，提升有機酸和蛋白產量。
  

   

• 米曲霉（Aspergillus oryzae）編輯ecdR基因，產物增產10-20%。

• 環保領域：設計合成微生物群落降解重金屬，如利用CRISPR編輯擬桿菌BT2086基因。

2. 農業革新

• 固氮微生物工程：編輯微生物基因使其持續固氮（如Pivot Bio的PROVEN® 40產品），田間試驗可替代40磅/英畝合成氮肥，減少污染。

• 作物保護：根霉（Rhizopus arrhizus）通過RNA干擾技術降低毒素生成，減少宿主損傷。

3. 醫學與健康

• 藥物生產：絲狀真菌（如Mucor circinelloides）突變crgA基因，增加類胡蘿卜素產量用于藥物合成。

• 抗感染研究：改造微生物增強唑類藥物敏感性，對抗真菌感染。